3. Material und Methode

3.1. Versuchstiere

Nach Eröffnung des Brustkorbes wurde das Herz entnommen und aus dem linksventrikulären Myokard fünf Blöckchen geschnitten. Jedes dieser Blöckchen wurde nach später aufgeführten Techniken eingebettet, fixiert und kontrastiert.

Sowohl für die lichtmikroskopischen wie für die elektronenmikroskopischen Auswertungen standen vier Altersstufen herzgesunder und vier Altersstufen cardiomyopathischer Hamster sowie pro Alter 5 Tiere zur Verfügung.

Für die Auswertung im Elektronenmikroskop sowie für die Auszählung der Volumenanteile des Interstitiums im Lichtmikroskop benutzten wir Tiere der Kontrollgruppe im Alter von 7, 21, 112 und 330 Tagen und cardiomyopathische Hamster im Alter von 7, 21, 270 und 390 Tagen. Die lichtmikroskopischen Ergebnisse der Kapillarzählung wurden im Alter von 21, 42, 120 und 330 Tagen bei den gesunden und im Alter von 21, 35, 180 und 390 Tagen bei den erkrankten Hamstern erhalten.

3.2. Präparatherstellung

Anschließend führten wir die Fixierung mit Karnovsky-Lösung (2 %iges Glutaraldehyd, 2 %iges Paraformaldehyd) über zwei bis drei Stunden durch, gepuffert wurde mit 0,1 m Cacodylatpuffer (pH 7,3) bei 4 Grad C. Danach wurde mit Cacodylatpuffer ausgewaschen.

Die Nachfixierung über zwei Stunden erfolgte mit 1%igem Osmiumtetroxyd in 0,1 m Cacodylatpuffer, und danach folgte wiederum das Auswaschen in Cacodylatpuffer. Danach fand eine stufenweisen Entwässerung in 50 % und 70 %igem Aceton statt. In letzterem wurden die Blöckchen mit 1 %igem Uranylacetat und Phosphorwolframsäure kontrastiert und nach Entwässerung in 90 %igem und wasserfreiem Aceton in Durcupan (Fluka) eingebettet. Anschließend fertigten wir Semidünnschnitte mit einer Dicke von 0,5 bis 1,0 µm zur Zielpräparation an.

Zur elektronenmikroskopischen qualitativen und quantitativen Auswertung wurden mit Hilfe des Tesla-Ultramikrotoms BS 490 A und z.T. mit dem Ultracut E (Fa. Reichert) 0,065 µm dicke Ultradünnschnitte hergestellt.

Die mit Uranylacetat und Bleicitrat nachkontrastierten Schnitte fotografierte man auf unbefilmten Kupfernetzplatten und bei 6.000 bzw. 20.000facher Vergrößerung mit dem Elektronenmikroskop Tesla BS 500 und z.T. mit dem Elektronenmikroskop 900 (Zeiss/Oberkochen) auf ORWO-Elektronenplatten EU-2 bzw. auf Codac-electron-microscope-film. Zur lichtmikroskopischen Auswertung wurden routinemäßig mit Toluidinblau gefärbte Semidünnschnitte verwendet. Für einen Teil benutzten wir die Färbung nach MOVAT: Nach Auflockerung des Harzes behandelten wir die Schnitte zunächst mit 1 %igem Wasserstoffperoxid, danach stufenweise mit Alkohol und anschließend mit 1 %iger Perjodsäure. Nach Spülung mit Aqua dest. wurde das Präparat mit kalter Silbernitratlösung nach MOVAT gefärbt. 50 ml gebrauchsfertige MOVAT-Lösung enthalten: 40 ml 3 %iges Hexamethylentetramin, 5 ml 5 %iges Silbernitrat und 5 ml 2 %iges Borax.

Die lichtmikroskopische Auswertung erfolgte mit dem Projektionsmikroskop Zeiss-Lanameter bei 420facher Vergrößerung.

3.3. Morphometrische Technik und statistische Auswertung

3.3.1. Morphometrische Technik an gefärbten Semidünnschnitten:

Aus jedem Schnitt wurden durch mäanderförmiges Verschieben bis zu vier Meßfeldern ausgewertet, wodurch kein Bildfeld mehrmals herangezogen wurde.

Somit standen pro Alter zwischen 24 und 72 Bildfelder zur Auswertung zur Verfügung. Die Auszählung der Kapillarquerschnitte bzw. Querschnitte der Muskelfaserbündel erfolgte ebenfalls mit Hilfe eines Netzrasters mit einer Kantenlänge von 166 µm (=0,166 mm) und einer Gesamtfläche von 27.556 µm² (=0,027 mm²).

Alle die rechte und obere Seite berührenden Querschnitte bezog man nicht ein. Folgende Parameter ergaben sich:

• Anzahl der Kapillarquerschnitte Ni Kap.
• Anzahl der Cardiomyozytenquerschnitte Ni Myo.

3.3.2. Morphometrische Technik an Ultradünnschnitten

Es wurden folgende Meßverfahren verwendet:

A. Treffermethode an unbegrenzten Objekten zur Ermittlung der Volumendichte VV der

• Fibrozyten
• Fasern (Bündel längs- und querverlaufender Fasern)
• extrazellulären Matrix.

Es wurde ein Netzraster mit der Gesamtpunktzahl von 416 und einem Punktabstand von 2,5 mm verwendet. Auch hier wurden nur Punkte in die Zählung einbezogen, welche die Struktur direkt trafen oder sie von der linken oder unteren Seite berührten.

B. Linienschnittmethode zur Ermittlung der Oberflächendichte SV der

• Fibrozyten

Es wurden nur Schnittpunkte mit der äußersten Kontur der zu messenden Struktur der linken und unteren Seite gewertet.

C. Ermittlung der Anzahl Ni der

• Fibrozyten
• Vesikel

Folgende Primärparameter wurden aus den Treffer- und Linienschnittpunkten bzw. aus der Anzahl der Objekte entsprechend der Formeln 1 - 3 errechnet:

• Volumendichte VV
• Oberflächendichte SV
• Anzahl NA

• numerische Dichte NV
• Verhältnis der Oberfläche zur Volumendichte SV/VV

Zur morphometrischen Auswertung (siehe Formel 4 - 6) der Kapillaren wurden folgende Methoden benutzt:

A. Mit Hilfe eines achtstrahligen Sternrasters erfolgte die Ermittlung der:

• durchschnittlichen Lumenweite dLumw durch mittiges Auflegen des Rasters und Abtragen mit Hilfe des Stechzirkels
• durchschnittlichen Endotheldicke dEND nach o.g. Methode.

B. Mit Hilfe des halbautomatischen Bildauswertsystems MOP - 3 wurde die

• Basalmembrandicke dBM
• Kapillarwandfläche A Kap. als Bezugsfläche für die Anzahl der Vesikel ermittelt.

3.4. Methodenkritik

Um diese möglichst gering zu halten, müssen folgende Voraussetzungen erfüllt sein (Weibel 1966):

• ausreichende Zahl der Gewebspartikel
• eindeutige Identifizierbarkeit
• auszuwertende Strukturen sollen in allen Teilen des Objektes hinsichtlich Größe und Form ähnlich sein
• auszuwertende Strukturen sollen bezüglich der Schnittebenen zufällig orientiert sein

Um bei der Stichprobenauswahl die Zufälligkeitskriterien zu gewährleisten, wurde der Schnitt vor dem Fotografieren mäanderförmig verschoben. Generell wurden alle ermittelten Werte als Relativwerte zur Kontrollgruppe ermittelt, so daß die auftretenden Fehler in allen Gruppen gleich sind.

Kritisch zu diskutieren ist die elektronenmikroskopische Präpariertechnik. Es ist bekannt, daß eine auch nur kurzzeitige Hypoxie zwischen Materialentnahme und Fixation zu Schäden in der Ultrastruktur, wie das Kollabieren von Kapillaren, führen kann, was die Ergebnisse wesentlich beeinflußt. Es wurde deshalb ein möglichst schnelles Zuführen der Proben zur Fixation sowie ein gleichmäßiges Durchdringen mit der Fixationslösung durch genügend kleine Proben gewährleistet.

Um Artefakte durch unterschiedliche Reaktionen auf die Fixationslösung, wie fixationsbedingte Schrumpfungen, zu vermeiden, war es notwendig, immer gleiche Stellen der Herzmuskelblöcke für die morphometrischen Auswertungen zu benutzen.

Da innerhalb der Herzmuskelblöckchen ganz außen eine überfixierte, darunter eine normal fixierte, unter letzterer eine unterfixierte innere Zone zu unterscheiden sind, wurden die Ultradünnschnitte nach Routine des elektronenmikroskopischen Labors des Institutes für Anatomie der Universität Leipzig stets aus der optimal fixierten Zone gewonnen. Die subjektiven Fehler, welche beim Messen und Selektieren auftraten, wurden gering gehalten, da alle Messungen von einer Person vorgenommen wurden.

Systematische Fehler, welche z.B. durch Schrumpfungen zustande kamen, trafen für das gesamte Material zu und waren somit überall vorhanden. Es wurde versucht, durch eine standardisierte Methode diesen Fehler gering zu halten.